我现在要研究一种蛋白质的酶活性，这个蛋白家族的另外一个同源蛋白有一种水解酶活性，我现在想要研究我这种蛋白是否也有这种酶活性。开始我是直接用转染了蛋白的细胞 homogenate 加上底物体外反应后做质谱，检测到水解产物，但是因为cellhomogenate 里有太多的各种蛋白了，所以结果没有直接的说服力。现在我想用his tag来纯化我这种蛋白。
我的问题是我在裂解转染的细胞的时候肯定是不能加蛋白酶抑制剂的，否则纯化的蛋白就没有活性了，可是纯化有这么多的步骤，经过很长的时间，我如何保证我的蛋白在纯化过程中不被细胞中的各种蛋白酶降解呢。另外，我用His60 Ni resin 来纯化蛋白，这个beads 是在ethanol 里，有没有必要在将bead加到细胞裂解液中之前洗掉bead中的ethanol? washing buffer 中的imidazol 对蛋白活性有影响吗？
还请有蛋白纯化经验的前辈指教一二。多谢了
评论 (0)