蓝藻的杀手锏――准生物武器

天空有“灰”霾，水中有“绿”霾，在表观上都使我们失去清澈，而内在地都使我们失去健康......在一些关于生物武器的书中，蓝藻水华的次生代谢产物——微囊藻毒素（microcystin，简称MC）赫然在列，因为它的毒性达到了河豚毒素的1/6，居然引起武器专家的兴趣。可悲的是，这样的恐怖武器却堂而皇之地占据着我们的大江大河（如滇池、太湖、巢湖、富春江等），一步一步地蚕食者我们的躯体，特别是我们的重要器官——肝脏......

《防御毒素武器》 《便携式化学传感器：应对生物恐怖的武器》

微囊藻毒素通过淡水生态系统食物网向人的传递（Chen et al. 2016）

微囊藻毒素的结构于20世纪80年代初被确认（Botes et al. 1984, 1985），因为这类化合物首先从一种蓝藻-铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）中分离得到，因而被命名为 “microcystin”（Carmichaelet al. 1988）。MC在结构上是一种环肽，迄今为止已有75种以上的MC被确认（Svrcekand Smith 2004），在对动物的毒性方面，其主要靶器官为肝脏。MC对哺乳动物的毒性很强，主要是通过强烈抑制二种蛋白磷酸酶（PP1和PP2A）的活性（Yoshizawa et al.1990）。

一、MC的化学结构

MC是一类结构上有联系的单环七肽化合物，其一般结构如图1所示。MC的结构特征是其具有一个被称为Adda的特殊的20碳β氨基酸（[2S，3S，8S，9S]-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8, -三甲基-10-苯基癸-4, 6,-二烯酸）（[2S，3S，8S，9S]-3-amino-9-methoxy-2,6,8,-trimethyl-10-phenyldeca-4,6, -dienoic acid）。此外，MC还含有3个D型氨基酸-丙氨酸（alanine）、MeAsp（也称为Masp）（赤-β-甲基天冬氨酸erythro-β-methylasparticacid）和谷氨酸（glutamic acid）、Mdha （N-甲基脱氢丙氨酸N-methyldehydroalanine）和二个可变的L-氨基酸（McElhiney and Lawton 2005）。

虽然MC的结构变异在七个氨基酸都能发生，但最常见的变异主要是发生在2、4号位上的二个可变L-氨基酸（图1中的X和Z）、以及MeAsp和Mdha残基的甲基化模式（Sivonen and Jones 1999）。MC的命名也是根据2、4号位上的二个可变氨基酸而得，譬如，最常见的MC-LR在可变氨基酸位置含有亮氨酸（leucine）和精氨酸（arginine），分子量为994 Da。

二、产毒蓝藻与MC的毒性

MC是一类由蓝藻产生的天然毒素，这些蓝藻包括

Microcystis、Anabaena、Planktothrix、Anabaenopsis、NostocAphanocapsa和Hapalosiphon（图2）（Carmichael 1992, Skulberg et al. 1993，Svrcek and Smith 2004）。MC属于蓝藻的次生代谢产物（Secondary metabolites），因为它们并不用于主要的代谢过程（如细胞分裂和产能）（Svrcek and Smith 2004）。在产MC的蓝藻类群中，有些能产多种蓝藻毒素（表1），这样使根据生物类群来判断毒素种类变得困难。

虽然迄今为止人们还未能确切地知道为何蓝藻要产毒素以及在什么环境条件下产毒，但MC的合成途径已经比较清楚，其较小的分子量、环状结构以及含有特异性的氨基酸表明这些肽类是非核糖体（non-ribosomally）途径合成的（Meissner et al. 1996, Dittmann et al. 1997）。而非核糖体肽类合成酶（peptide synthetases）在结构上高度保守，这些肽类合成酶的基因编码是组件式的（modular），每个基因模块（module）含有单个肽合成酶单元（peptide synthetase unit），因此一个藻株的产毒能力可能主要取决于是否具有这些基因以及它们在特定环境下的表达（Hitzfeld et al. 2000）。

图2 美丽的产毒蓝藻

表1蓝藻毒素的名称及产毒生物

（引自 Svrcek and Smith 2004）

MC与许多人工合成的有机污染物不同，只要水体中有产毒蓝藻存在，它就可以产生，只是当它们很微量的时候，不会对人类和其它水生动物产生明显的毒害作用；而当水体严重富营养化时，产毒蓝藻往往大量爆发（常常形成厚厚的蓝藻水华，如图3），MC会源源不断地产生并被大量释放到水体中。

在有机化学中，根据氨基和羧基的相对位置将氨基酸分为α-、β-、γ-等氨基酸；将其它化合物与甘油醛进行比较，若Fisher投影式中手性碳上的取代基在碳链右边，称该化合物为D-型，反之称为L-型。天然的蛋白质氨基酸主要是α-氨基酸，而β和γ氨基酸很少见；此外，天然的蛋白质氨基酸都是L型的（荣国斌和苏克曼2000）。很显然，MC主要是由非蛋白源性氨基酸构成。迄今为止，Adda仅发现存在于MC和与其在结构上有联系的肝毒素-五肽节球藻毒素（pentapeptide nodularin）中（Rinehart et al. 1994）。

由于肽类在人体内易与口腔、胰腺溶酶体内的蛋白水解酶作用而迅速降解，随即被肝脏处理排出（因此生物利用度低、半衰期短），在肽类药物合成中，常通过化学修饰（如环化、引入D-氨基酸、Nα-烷基化氨基酸、Cα-双烷基化氨基酸等）提高肽类药物在体内的稳定性（Sewald and Jakubke 2002）。从MC的环状结构、以及主要由D-型和特殊氨基酸组成的特点推测，MC可能比蛋白源性多肽在动物体内具有更高的代谢稳定性。

由于MC中含有C=C双键，双键两侧的基团在空间的位置不同引起顺反异构。在有机化学中，烯烃碳碳双键C1和C2上原子序数大的原子或原子团在双键平面同一侧时，称为"Z"构型，在异侧时为"E"构型。Adda残基中的C6双键有扩展的反式构型（E构型）和顺式构型（Z构型）二种，已从自然水体的水华蓝藻中确认并分离得到MC-LR和MC-RR的二种几何异构体（Haradaet al. 1990a, b, 吴冬辉等1994），以反式构型（E构型）为主（Tsuji et al. 1994）。

大量的研究报道了MC在淡水和咸淡水环境中的存在（Dawson and Holmes 1999），只有少数报道MC存在于海洋环境（Andersen et al. 1993, Chen et al. 1993, Williams etal.1997b）。

图1 微囊藻毒素的一般结构：环（D -丙氨酰1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D谷氨酰6-Mdha7）。D-MeAsp为D-赤-β-甲基天冬氨酸。Aba=胺基异丁酸，ADMAdda=O-乙酰基-O-去甲氧基Adda，Dha=脱氢丙氨酸，Dhb=脱氢酪氨酸; DMAdda= O-去甲氧Adda，Me-D-Asp=赤-β-甲基-D-天冬氨酸，Glu(OMe)= 谷氨酸甲酯， (H4)Tyr=1,2,3,4.-四氢酪氨酸， Har=高精氨酸，Hil=高异亮氨酸，Hph=高苯丙氨酸， Hty=高酪氨酸，Mdha=N-甲氧基脱氢丙氨酸，Melan=N-甲基羊毛硫氨酸， Met (O)=蛋氨酸-S-氧，MeSer=N-甲基丝氨酸，(6Z)Adda= Adda在△6双键处的立体异构体，1)R1=Me，2)R1=H，3)R2=Me，4)R2=H

（引自McElhiney and Lawton 2005）

1. 水溶解度

有机化合物在水相的平衡浓度（或饱和浓度）称为化合物的水溶解度。由于很难得到大量的MC纯品，通过向一定体积水中不断添加MC直至饱和以及出现可见的沉淀来测定溶解度的方法是困难的。Rivasseau等（1998）通过间接的方法进行了估算：在25oC的条件下，将超纯水加入装有已知量的MC-LR的微小样瓶（microvial）中，再通过色谱峰面积估算溶解量，并用甲醇作为参照来进行校正；在2 g l-1的理论浓度下，有90±3%MC-LR溶解在水中，在1 g l-1的浓度下，有96±3%MC-LR溶解在水中；虽然无法得出一个准确的溶解度值，但可以推测，MC-LR在水中的溶解度>1g l-1。

2. MC-LR的酸碱解离常数

关于酸碱性质（化合物与环境中的水之间的酸碱相互作用），主要表现在化合物的解离常数Ka或Kb上。根据游离氨基酸的测定数据，MC-LR中3个可解离基团（2个羧基和1个氨基）的pKa值（阳离子和阴离子各占一半时的pH值）分别为2.09、2.19和12.48（Chang 1981）；但这些pKa值可能与结合在肽键中的氨基酸的值稍有差异（De Maagd et al. 1999）。依据这些pKa值，可推测出不同pH环境中MC-LR的优势形态如表3所示。

表3 不同pH值下MC-LR的优势形态

引自De Maagd et al.1999）

一种化合物在C18柱（octadecylsilica,ODS）上的保留因子kw（retentionfactor）（以水作为洗脱液）可用来估算该化合物的疏水性（hydrophobicity）。Rivasseau等（1998）通过测定pH=7时MC的kw，估算了MC的pKa值如表4所示。由此可见，MC的羧基的电离pH为3.3-3.4，在自然环境中的MCs为中性或带负电荷；根据水溶性和极性作用，MCs易保留在水相而不易被沉积物或颗粒悬浮物所吸收。

表4 MC的若干物理化学数据：外推的log kw和 pKa，以及被悬浮颗粒物和砂质沉积物所吸附的MC的百分比（经过3天振荡）（n=2）

（引自Franz 1997）

由于大多数MC是亲水的，一般不能直接穿过脊椎动物的细胞膜，因此需要ATP依存性的转运蛋白（ATP-dependenttransporter）来吸收，一个还未被确认的多种有机阴离子转运蛋白或胆汁酸转运蛋白（bile acid transporter）被认为是大白鼠肝脏中这些环肽的载体（carrier）（Runnegaret al. 1981, 1982, Eriksson et al. 1990a），因此，MC的毒性限于像肝脏这样其细胞膜含有有机阴离子转运蛋白的器官（Hitzfeld et al. 2000）。

三、MC的化学性质

有机污染物的物理化学性质（如水溶解度、蒸汽压、挥发性、在水中的稳定性、光降解速率、酸碱解离常数、辛醇-水分配系数等）影响着它们在环境中的分配、吸附、生物富集及毒性等。一般来说，有机化合物的物理化学数据可在严格的实验条件下测得，这些数据一般在新化合物注册时是必需的。然而，由于MC为天然产物，且一般能获得的标样量很少且价格昂贵，所以有关其物理化学性质方面的研究甚少（Rivasseau et al. 1998）。

图4 MC-LR的结构（修改自Carmichael1994）

在对MC的物理化学性质的研究中，以对MC-LR（图4）的研究最多。MC-LR含有二个可解离的羧基（ionizable carboxyl groups）和一个可解离的氨基（ionizable amino group），它们未参与形成构成环肽结构的肽键（Rudolph-Bőhner et al. 1994）。由于羧基既是很强的H-受体，也是很强的H-供体，即羧基的存在将显著提高化合物的水溶解度；氨基也会参与氢键的形成，可作为H-供体（Schwarzenbachet al. 2003），因此可以推测MC-LR具有很好的水溶性。

图3a 太湖的蓝藻水华

图3b 浙江富春江的蓝藻水华（2016年8月）

水体中的蓝藻水华可由一至数个优势种组成（其中一些可能产毒），即使是由单个种类形成的水华，也可能是有毒和无毒株的混合体，已知的蓝藻水华中有60-70%含有毒株（Fawellet al. 1993, Sivonen and Jone 1999, Svrcek and Smith 2004）。在某一个期间的水华可产生几种MC，在一些情况下甚至可达20多种；一种蓝藻水华的毒性取决于有毒株细胞的浓度，以及所出现的毒素的相对毒性（Svrcek and Smith 2004）。已报道的从自然水体中采集的水华蓝藻中的MC含量，以中国的7300μg g-1 dw（Zhang et al. 1991）和葡萄牙的7100 μg g-1 dw（Vasconelos et al. 1996）为最高。虽然MC还未达到用于制造大规模杀伤性生物武器（Mass Casualty Biological Weapon, MCBW）的程度（由于生产困难、毒性还不是足够强烈），但其毒性已经达到引起军事专家关注的程度（表2）。一些神经毒素能有效地终止神经和肌肉的功能而不引起组织显微结构的破坏，而其它一些毒素直接破坏和损伤组织，对这些毒素，预防十分重要，因为常常在数分钟或数小时内就可发生不可逆的病理变化，MC就属于这种类型。MC专一性地与肝细胞内的蛋白磷酸酶结合，而不损伤体内的其它细胞，除非肝细胞对MC的吸收被阻隔。在致死剂量暴露的情况下，15-60 min 之内即发生不可逆的器官损伤，在这种情况下，具有重要功能的肝脏被严重损伤以致治疗可能作用甚微或毫无价值；由于许多毒素影响体细胞、组织和器官的基础代谢过程，阻止毒素的药物也常常会带来复杂的有毒副作用，而用来保护实验动物免受MC毒害的利福平（Rifampin，抗结核病药）对人却是安全的（Franz 1997）。

表2 所选的毒素与化学毒剂对实验小白鼠致死性的比较

3. MC-LR的正辛醇-水分配系数的直接测定

正辛醇是最广泛使用的预测有机化合物在天然有机相和水之间分配的有机溶剂，测定辛醇-水分配系数（Pow）最常用的实验方法与测定水溶解度相似，即采用摇瓶法（限于Pow <105的化合物）或产生柱法（用于强疏水性化合物）（schwarzenbach et="" al.="">

从表3可见，当pH 在2.09和2.19之间时，主要是净电荷为0的两性离子（zwitter ion with no net charge），这是MC-LR最中性（neutral）的形态，该形态也可能最容易分配进入辛醇；而在蓝藻可能大量繁殖的pH范围（6-9），Pow值可能较低（De Maagdet al.1999）。

De Maagd 等（1999）在25oC的条件下，采用摇瓶法测定了不同pH条件下MC-LR在辛醇-水中的分配比率的对数值（the log n-octanol: water distrubutionratio, log Pow）。结果表明，MC-LR的log Pow与pH密切相关，即当pH从1上升到10时，log Pow逐渐从2.18降低到-1.76（图5），但log Pow在羧基的pKa值附近并无大的变化。根据表3和图6可见，(COOH)2(NH2+)形态的MC-LR比(COO-)2(NH2+)形态的MC-LR分配进入正辛醇的能力要强得多。De Maagd等（1999）用HPLC法测定过MC-LR，当DOW特别小时灵敏度有限（图6a），而Liang等（2011）用LC-MS测定时就克服了这样的困难（图6b）。

图5 pH对MC-LR的辛醇-水分配比率的对数值（log Pow）的影响（测定方法：HPLC法）。□=一次测定值，

图6 用LC/MS测定正辛醇-水分配系数（Liang et al. 2011）

四、环境因子对MC稳定性的影响

1. pH和温度对MC-LR稳定性的影响

Harada等（1996a）在实验条件下研究了pH（1、5、7、9）和温度（5、20、21~30、40oC）对MC-LR稳定性的影响。在日本，夏季蓝藻水华发生时湖水常见的pH为9~10、温度为25~30oC。当温度为5oC和20oC时，在上述4种pH条件下MC-LR很少分解（图7）；当温度为40oC时，MC-LR的半衰期为3周（pH=1）或10周（pH=9）。而模仿夏季自然条件下的降解速率比pH=9、温度=40oC时稍慢。因此，MC的热力学降解（thermaldecomposition）比其它因子的作用小。

MC-LR分子的降解方式受到环境条件的影响。在温度为40oC及pH=1（37 d）或pH=9（100d）的条件下，MC-LR的降解产物主要是通过Mdha残基的水解而形成几种线形化的肽类（可能无毒），最初的水解发生在Mdha残基处（因其具有烯胺enamine结构）；而当甲醇存在时，在酸性条件下，酯化（esterification）作用远比水解作用重要（图8），所产生的甲酯无毒，对PP-1和PP-2A无抑制作用。

此外，Wannemacher（1989）在实验条件下证实，MC-LR在300oC下仍然稳定。最近的研究表明，烹饪不仅不能减少MC，反而使一些结合态的MC游离出来，增大风险（Zhang et al. 2010，图9）。

图7 pH和温度对MC-LR的稳定性的影响（引自Haradaet al. 1996a）

图8 MC-LR在不同温度和pH条件下的降解图解（引自Harada et al. 1996a）

图9 烹饪对鱼肉中MC稳定性的影响（引自Zhang et al. 2010）

2. 光照对MC稳定性和异构化的影响

Harada等（1990a, b）首次从二个日本湖泊（Tsukui湖和Sagami湖）的水华蓝藻（主要是Microcystisviridis）中分离得到MC-LR和-RR的二种几何异构体（Geometrical isomers）：Adda残基中的C6双键从扩展的反式构型（E构型）改变为顺式构型（Z构型）（图10）。Z构型的毒性远低于其母体（E构型）（Harada et al. 1990a）。在日本，有毒蓝藻水华中MC的异构体（Z构型）比例一般为5-15%（Tsuji et al. 1994）。在我国云南程海湖的蓝藻水华样品（Microcystis aeruginosa约占90%）中，也发现MC-RR及其同分异构体的存在（吴冬辉等1994）。

图10 MC-LR和-RR的几何异构体的结构：6(Z)-Adda MC-LR和 6(Z)-AddaMC-RR（引自Harada et al. 1990b）

Tsuji等（1994）研究了在各种色素溶液中光照对MC-LR稳定性和异构化的影响。将溶于蒸馏水中的MC-LR和其几何异构体6(Z)-AddaMC-LR（以85:15的比例混合，浓度0.007-14 mg l-1）置于太阳光或日光灯照射，经过26 d，仍然有86%以上MC-LR存在，虽然在太阳光照射和MC-LR浓度为14 mg l-1的情况下，异构率（isomerization ratio）有轻微变化，其它条件下无显著变化。因此，MC-LR和其几何异构体对光照是稳定的。

将色素分为溶剂（丙酮）可提取色素（主要为β-胡萝卜素、叶绿素和一种红色类胡萝卜素mixoxanthophyll）和水可提取色素（藻蓝素）。在太阳光照射的条件下，色素的存在加速了MC的降解，而与纯叶绿素a和β-胡萝卜素相比，水可提取色素更能使MC有效地降解（图1-11A）；但是在日光灯照射的条件下，在色素溶液中的MC-LR并未显著降解。MC-LR及6(Z)-Adda MC-LR都渐渐向其对应的异构体转化，在水可提取色素存在的条件下，经过18天达到平衡，此时的异构率约为0.55（图1-11B）。在太阳光照射的条件下，不同浓度的水可提取色素对MC-LR稳定性和异构化有显著影响：色素浓度越高MC-LR的分解速度越快（图1-12A），在6天和8天内，异构率与色素浓度之间存在线形关系（图1-12A），但是超过8天后，不存在这种关系，由于MC-LR和其异构体均逐步被完全分解。MC-LR的分解和异构化同时发生，但在色素浓度较高的情况下，分解过程占主导。色素和光对MC-RR和-YR的降解及其几何异构率的影响与对MC-LR的作用类似，三种毒素（MC-LR、-RR和-YR）的异构率之间的无显著差异。

图11 在各种色素溶液中以及在日光照射条件下，（A）MC的下降（1990年11月）和（B）MC-LR和6(Z)-Adda MC-LR的异构化（1991年4月12日-5月9日）。（A）（♦）叶绿素a（20 mg l-1）、（◊）β-胡萝卜素（20 mgl-1）、（○）水可提取色素（5mg l-1）、（∆）溶剂（丙酮）可提取色素（5mg l-1）、（□）无色素的蒸馏水。（B）（

图13 238、242和254 nm UV照射对MC-LR的分解（引自Tsuji et al. 1995）

图14 用不同光密度的254 nm UV（通过灭菌灯）照射对MC-LR的分解（引自Tsuji et al. 1995）

用较低光密度（400μW/cm2）的UV（254 nm占85-95%）照射30分钟，MC-LR出现几种异构体：6(Z)Adda MC-LR和4(Z)Adda MC-LR（图15），这与在色素存在条件下的太阳光降解有所不同；此外MC-LR和6(Z) Adda MC-LR向各自的异构体转化（异构率）的平衡点约为0.2-0.26（图16）。

图15 4(Z)-Adda MC-LR的结构（引自Tsujiet al. 1995）

图16 紫外线（氘灯）照射下MC-LR和6(Z)-Adda MC-LR异构化（A）和异构率（B）的时间变化。MC-LR和6(Z)-AddaMC-LR分别简称LR 和 LR-6(Z)（引自Tsuji etal. 1995）

4. 盐度对MC稳定性的影响

Mazur和 Pliński （2001）在17±1oC的水温及连续光照（40 μmol photon m-2s-1）条件下，研究了不同盐度（0、4、8、16和24 PSU）对MC-LR和MC-RR稳定性的影响。1）当MC（0.2 mg l-1）置于灭菌的BG-11培养液时，经过1周的时间，在所有盐度条件下的MC含量均未发生显著变化，3个星期后MC浓度逐渐下降到初始浓度的约60%左右（图1-17、图1-18）；2）当MC置于未灭菌的海水（仅用GF/C滤膜过滤）时，MC的降解速度比在BG-11培养液中为快：3周后MC-RR和MC-LR分别降至初始浓度的18.7和9.5%，这可能与未灭菌海水中存在的细菌的分解作用有关；3）当用Microcystis aeruginosa PCC 7820抽提物（内含MC-LR）代替纯MC-LR时，3周后抽提物中的MC-LR在BG-11培养液中的浓度降到了检测限以下，这可能是由于蓝藻细胞抽提物中存在某些化合物加速了MC-LR的降解。

图1-17 在不同盐度（0、4、8、16和24 PSU）条件下，BG-11培养液中MC-LR浓度的变化（引自Hazurand Pliński 2001）

图18 在不同盐度（0、4、8、16和24 PSU）条件下，BG-11培养液中MC-RR浓度的变化（引自Hazurand Pliński 2001）

五、MC致毒的分子机制

蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化和去磷酸化，在调节许多细胞的生化过程中具有重要功能，如信号传导和蛋白质释放过程中酶的激活和抑制。蛋白激酶（protein kinase, PK）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PP）作用于蛋白质中出现的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基，分别影响它们的磷酸化和去磷酸化，所有有机体均借此调节各种细胞内生命过程（Sewald and Jakubke 2002）。二十世纪九十年代初，一些科学家几乎同时发现MC-LR能强烈地抑制蛋白磷酸酶的活性（Honkanen et al. 1990，MacKintosh et al. 1990，Yoshizawa et al. 1990）。

1. 蛋白磷酸酶及其抑制剂

蛋白磷酸酶分为三个家族：磷酸化酪氨酸残基蛋白磷酸酶（phosphotyrosine residues phosphatases, PTP）、磷酸化丝/苏氨酸残基蛋白磷酸酶（phosphoserine and phosphothreonine residuesphosphatases, PPP）和Mg2+依赖的磷酸化丝/苏氨酸残基蛋白磷酸酶（Mg2+-dependent phosphoserine andphosphothreonine residues phosphatases, PPM）；真核生物的PPP家族可进一步分为PP1、PP2A、PP2B和PP2C四类，其中，PP1主要作用于磷酸化酶激酶的β亚基，PP2A作用于磷酸化酶激酶的α亚基，PP2B需要Ca2+激活，PP2C需要Mg2+作为辅助因子，后来又发现PP3、PP4、PP5、PP6、PP7等新成员（刘卫军2003）。PPP存在于所有真核细胞类型，参与许多细胞过程（包括细胞周期进程、细胞增殖、蛋白质合成、转录调节、神经传递）的控制（Cohen 1989, Shenolikar1994）。

MC-LR能强烈地抑制PP1和PP2A的活性：对PP1、PP-2A和PP-2B的IC50分别为0.2 nM、0.2 nM和200 nM（Dawson and Holmes 1999）。MC与PP-1和PP-2A的结合最初是非共价的，但也抑制酶活性；经过数小时后MC与PP-1和PP-2A形成共价结合（covalent linkage），导致PP1和PP-2A的不可逆的改变（MacKintosh et al. 1994, 1995, Craig et al. 1996）。MC与PP1和PP2A的结合对凝胶过滤（gelfiltration）、三氯乙酸（trichloroacetic acid）以及在1%的十二烷基磺酸钠（SDS）溶液中加热至100oC都是稳定的（Robinson et al. 1991a,Moorhead et al.1994, MacKintosh et al. 1995）。对蛋白磷酸酶有抑制作用的天然毒素不仅仅限于MC。节球藻毒素（Nodularin）、由海洋双鞭毛类产生的大田软海绵酸（Okadaic acid）、斑蝥（一种甲虫）产生的斑蝥素（Cantharidin）、花萼盘皮海绵产生的花萼海绵诱癌素（calyculin A）和由一种真菌产生的互变霉素（Tautomycin）等都能抑制蛋白磷酸酶的活性（Honkanen et al. 1994）。由于真核生物体内的蛋白磷酸酶结构保守且具有重要功能，可能导致在进化的过程中这些酶容易成为这些毒素的攻击目标（MacKintosh et al. 1995）。

2. MC-LR和PP-1复合物的晶体结构

根据1H NMR谱分析，MC-LR有一个马鞍形骨架，Adda残基侧链突出在其后（Bagu et al. 1995）。MC-LR的自由溶液NMR结构（freesolution NMR structure）与其同PP-1共价结合后的X射线晶体结构（X-ray crystal structure）在构象（conformation）上没有显著差异（图1-19），二个叠加骨架的方均根偏差（RMSD）为0.65 Å，表明MC-LR与PP-1共价结合后仍然保持了其自由构象，这可能是MC-LR对PP-1具有高亲和力（high affinity）的重要原因（Baguet al. 1997）。

图19自由溶液MC-LR和结合的晶体MC-LR的立体图示比较。MC-LR的最小平均自由NMR结构用红色表示，结合的晶体结构用蓝色表示。为清楚起见，氢原子均未标出（引自 Bagu et al. 1997）

MC-LR和PP-1结合的晶体结构如图1-20所示。MC-LR的Mdha与PP-1的Cys-273共价结合，MC-LR分子相对包埋在PP-1之中，而这与从海绵Theonellaswinhoei体内分离出的一种称为motuporin（或nodularin-V）明显不同，后者的Mdha残基在motuporin和PP-1复合物的表面突出（Bagu et al. 1997）。

图20 MC-LR和PP-1c晶体结构复合物的整体图像，PP-1c的原子用蓝色表示，所结合的MC原子用黄色表示（除Mdha残基用红色表示以外）（引自Bagu et al. 1997）

3. MC与PP-1的结合位点

MC-LR的7个氨基酸残基为：β连接的赤-β-甲基天冬氨酸（Masp）、L-精氨酸、Adda、γ连接的D-谷氨酸、Mdha、D-丙氨酸和L-亮氨酸。MC-LR具有坚固的马鞍型（rigid saddle-shaped）骨架，因而为其与PP-1之间的疏水、离子及共价连接提供了合适的框架：这些连接包括了Adda、Masp和Glu残基，而Mdha为二次共价结合（secondary covalent linkage）所必需；因为疏水性（hydrophobicity）可能是MC-LR和PP-1结合的最初的动力，Adda残基可能首先负责将其环状骨架锚定（anchoring）在PP-1的结合位点上；其它参与抑制作用的残基-Masp和Glu在马鞍下方的D型带负电的羧基正好与PP-1上带正电的Arg-96结合；最后，在抑制作用之后的二次共价结合依赖于位于毒性马鞍前端和顶端的被修饰的氨基酸Mdha与Cys-273之间的共价键（Bagu et al. 1997）。

从图21可见，MC与PP-1表面的三个位点进行结合：金属结合位点、疏水凹槽及邻近活性位点的C-端凹槽的边缘。Mdha侧链的β碳原子与PP-1的Cys 273形成共价键，γ连接的D-谷氨酸侧链羧基和邻近羧基的氧原子与二个水分子（W1和W3）形成氢键，Masp侧链的羧基与Arg 96 和 Tyr 134形成氢键，疏水的Adda残基包埋在由一些疏水残基形成的凹槽中，L-亮氨酸残基位于Tyr272侧链附近（Bagu etal. 1997）。

MC和PP之间的共价结合可能与致癌性的存在与否有关。Bagu等（1997）推测，MC-LR为何缺乏致癌性（carcinogenic），是因其亲电子的Mdha残基与PP-1和PP-2A形成了共价结合，从而不能再与其它大分子形成加合物（adduct）；而不能形成共价结合的motuporin和节球藻毒素nodularin可能具有致癌性，因其亲电子的Mdha残基即便与PP结合也可能还会与其它信息大分子的亲核基团形成直接的加合物。

图21 a，环状7肽MC-LR的分子结构式，b，MC-LR在PP1活性部位的立体图。MC-LR分子根据不同的原子类型进行编码：碳原子为绿色，氮原子为蓝色，氧原子为红色；主链和所选择的侧链蛋白原子为褐色，金属离子M1和M2（白色）和水分子W1、W2和W3（红色）用球形表示，Cys273的γ-硫原子用黄色表示。MC-LR的整体构型与通过核磁共振光谱仪（NMR）观察到的结果非常相似（引自Goldberg et al. 1995）

4. MC结构的改变对其毒性的影响

一般来说，由于环肽活性部分的柔性和构象限制，肽-受体相互作用的构象受到广泛关注（Sewald and Jakubke 2002）。Adda的整体形状对MC的毒性致关重要。譬如，当Adda残基中的C6双键从扩展的E构型改变为Z构型时，毒性大大降低：对蛋白磷酸酶的IC50增加100倍（Nishiwaki-Matsushima et al. 1992），对小白鼠腹腔注射MC-LR和-RR的LD50值分别大约为50和600 μg kg-1 BW（Krishnamurthy et al. 1986, Watanabe et al.1988），而注射其几何异构体（Z构型）时，高达1.2 mg kg-1 BW的剂量都未出现毒性（Harada et al. 1990a）。

Tsuji等（1995）的研究也表明，MC-LR与其异构体6(Z)-AddaMC-LR和4(Z)-AddaMC-LR的毒性差异巨大：二种异构体即使腹腔注射剂量达1.5 mg kg-1，也未产生肝毒性，而对PP-2A的抑制作用要低105倍（表5）。

表5 MC-LR的几何异构体的LD50（腹腔注射小白鼠）以及对蛋白磷酸酶2A的抑制效应

* 剂量达1.5 mg kg-1也未产生毒性Notoxicity at concentration up to 1.5 mg kg-1

（引自 Tsuji et al. 1995）（Cited from Tsuji et al. 1995）

从抑制大白鼠体内的PP1和PP2A以及导致其肝脏GPT（谷丙转氨酶glutamicpyruvic transaminase）向血液的释放量来看，6(Z)-AddaMC-LR 和 –RR仅为6(E)-Adda MC-LR 和 –RR的1/10-1/100（Nishiwaki-Matsushimaet al.1992）。

此外，Glu残基上的自由羧酸（carboxilic acid）对MCs的毒性至关重要，该基团的任何改变都会导致活性的完全丧失（Dawsonand Holmes 1999）。用乙硫醇（ethanethiol）还原MC-YR的Mdha残基，阻止了Mdha残基与PP1的共价结合，使MC-YR对野生型PP1的IC50值增加了5倍（表6）。

线型化使MC失去毒性。Choi等（1993）从Microcystis sp.中分离出MC的线形多肽前体（precursor），发现即便使用超过1 mg kg-1 BW的剂量，也未对小白鼠产生急性毒性。

MC的有些结构改变对毒性无明显影响，如Adda侧链上的C9处的脱甲基化对MC的毒性几乎没有影响；MC-LR的几个异构体（MC-LR中的可变氨基酸-精氨酸Arginine被丙氨酸Alanine、蛋氨酸Methionie、苯丙氨酸Phenylalanine、亮氨酸Leucine和高丝氨酸homoserine所取代）之间的毒性也无明显差异，这从Arg被取代的几种MCs对PP-1的IC50值（0.06-0.4nM）与MC-LR的IC50值十分接近得到证实（Crag et al. 1993, Dawson andHolmes 1999）。

蛋白磷酸酶结构的改变也能对MC的毒性产生影响。用Ala、Ser和Leu置换PP1中的Cys273可破坏MC-LR与PP1的共价连接，使MC-LR对PP1的IC50值增加10-20倍；而用Phe置换Tur272或用Ala置换Ser268则对IC50值无影响或影响不大（表6）。

表6 MC对野生型和突变型PP1催化亚单位的抑制。每个试验中PP1的浓度为0.05 nM，IC50为达到50%抑制时的浓度

（引自MacKintosh et al. 1995）

六、MC慢性暴露的致癌性

最近，中国科学院水生生物研究所东湖湖泊生态系统试验站（CERN）的何君博士等（He et al.2017）以小鼠为模型，运用系统毒理学研究了微囊藻毒素低剂量慢性暴露对哺乳动物的肝毒性及其机制，首次证实微囊藻毒素慢性染毒能显著抑制肝脏脂肪酸β氧化，阻碍脂蛋白分泌并促进肝脏炎症，导致小鼠非酒精性脂肪性肝炎发生，这可能是微囊藻毒素导致肝癌的重要途径，同时发现，世界卫生组织（WHO）推荐的日容许微囊藻毒素摄入量（TDI）水平的慢性暴露仍然存在健康风险，亟待修订。东湖站站长陈隽研究员等关于渔民的流行病学研究（Chen et al. 2009）、赵雁雁博士等利用小鼠的microRNA研究（Zhao et al. 2012）以及在读博士生陈亮等利用斑马鱼的系统毒理学研究（Chen et al. 2017）均支持慢性MC染毒诱导非酒精性脂肪肝炎的结论。

图22 MC诱导小鼠产生非酒精性脂肪肝炎（NASH）的示意图

东湖站的赵素娟博士等（Zhao et al.2016）以SD大鼠为研究对象，对母鼠从怀孕8天至子鼠出生16天进行染毒（共28天，通过Alzet渗透压胶囊以10 μg/kg MCLR/天的速率释放）。围产期的MC暴露使得子代肝脏胞间隙明显增大，并在肝脏检测出毒素，说明MC可通过血胎屏障，具有传代毒性。ROS和MDA含量上升，GSH含量下降，表明受到氧化损伤。蛋白组学发现染毒后45个蛋白的表达量发生变化，涉及到细胞骨架、氧化胁迫、代谢等方面，其中3个与肝细胞增殖和癌症发生密切相关的蛋白（TGM2, MAT1A, PPm1a）尤其值得注意（图23）。这些结果说明母源暴露对哺乳动物子代的传代（致癌）肝毒性不容忽视。刘莹博士等（Liu et al. 2010）和熊倩博士等（Xiong et al. 2009）发现MC能损伤大鼠的睾丸组织与精子，显著减少精子数量。生殖毒性不容忽视，这关系到我们子孙后代的命运（图24，Chen et al. 2006）。

图23 MC-LR诱导参与细胞凋亡或肿瘤发生的三个代谢蛋白（(Tgm2, MAT1a and PPm1a）的模式图

图24 微囊藻毒素生殖毒性致毒机制模式图（Chen et al. 2016）

结语

微囊藻毒素对温度和盐度等物理化学条件相当稳定，如果饮水或水产品中含有这种毒素，不要期待通过烧开水或烹饪能降解它。此外，蓝藻不仅有强烈的急性毒性，慢性肝毒性也得到了确认（Chen et al. 2009），致癌性的证据也逐渐浮出水面（Li et al. 2009, Zhao et al. 2012），致病机理也通过系统毒理学研究得到了的诠释——通过非酒精性脂肪肝炎，逐步迈向肝癌（He et al. 2017）。此外，它还损伤哺乳动物的雄性生殖系统，并具有传代（致癌）肝毒性。我们怎可以坐以待毙？