雪雀类的高原适应进化史

高海拔环境具有低温、低氧、强紫外线辐射的特点，对生活于其中的生物产生了强烈的选择压力，进而驱动了表型及遗传上的适应性进化。中国科学院动物研究所的鸟类学研究团队利用基因组和转录组数据，从种群水平到物种水平对高海拔适应的进化机制进行了系统的阐释。例如，地山雀（Pseudopodoces humilis）作为一种只在高海拔分布的山雀，不但是山雀科鸟类中体型最大的物种，其基因组中与能量代谢相关的基因也发生了扩张，低氧响应和骨骼发育相关的基因也受到正选择作用(Quet al., 2013)；另一方面，高原地区植被稀疏，此物种演化出了独特的地栖生活习性，比较基因组研究也揭示了COL27A1是导致其喙型延长的主效基因(Chenget al., 2020)。然而，不同的物种在向高原拓殖过程中可能具有不同的演化路径。高海拔山雀科物种的血红蛋白携氧水平尽管都有所提升，但在序列水平却表现出物种特异性(Zhuet al., 2018)；与之相反，从转录组水平来看，高海拔环境却能导致不同的物种呈现出相似的表达模式(Haoet al., 2019)。倘若将进化尺度缩短，将研究体系限定于同一物种的高低海拔种群（树麻雀Passer montanus），那么快速的表型进化则可能是多基因共同驱动的结果(Quet al., 2019)。树麻雀和雪雀类在青藏高原同域分布，亲缘关系较近，它们的SLC2A12基因与胰岛素敏感性和低血糖有关，通过提高胰岛素敏感性促进糖类代谢以适应高海拔的低氧环境(Xionget al., 2020; Xiong and Lei, 2020)。以上的研究或者关注于单个物种(Quet al., 2013; Quet al., 2019; Chenget al., 2020)，或者关注于少数近缘物种(Zhuet al., 2018; Haoet al., 2019)；那么，在向高海拔拓殖过程中，具有共同祖先的一个进化支系是否会演化出相似的或不同的适应性特征呢？近日发表于美国科学院院刊（PNAS）的文章中，中国科学院动物研究所和华大基因的研究团队对此问题进行了研究。

雪雀是少数在高海拔环境发生原位辐射（in situradiation）的鸟类谱系，包含雪雀属Montifringilla、白腰雪雀属Onychostruthus和黑喉雪雀属Pyrgilauda三个属，形成了一个单系群（monophyletic group）。雪雀类中共有7个物种，其中6个在青藏高原（Qinghai-Tibet Plateau, QTP）有分布----由此可以推断，雪雀物种对青藏高原的表型适应性很可能继承自它们的共同祖先。另一方面，现生的雪雀在形态、生态位和行为方面有所分化，又表明它们在从共同祖先分化之后又进化出了各自不同的适应性特征。

本研究选取了雪雀属三个具有代表性的物种进行了全基因组从头测序（de novo sequencing），整合表型、基因组和功能试验数据，揭示祖先适应对后代物种（descendant species）适应性进化的影响。

三种雪雀的高质量参考基因组

白腰雪雀（红）、棕颈雪雀（青）和褐翅雪雀（蓝）的采样点本研究选取了三个雪雀属的主要物种进行全基因组测序，分别为白腰雪雀Onychostruthus taczanowskii（简称为taczan）、棕颈雪雀Pyrgilauda ruficollis（简称为rufico）和褐翅雪雀Montifringilla adamsi（简称为adamsi）。作者结合同源建模、从头预测和RNA测序三种方法对基因组进行注释，注释结果中99.8%的蛋白质在公开数据库中有同源序列；BUSCO评估的结果也表明基因组注释较为完善，可用于后续分析。

三种雪雀的从头测序及组装结果

系统发育研究本研究使用全基因组数据，结合七个鸣禽作为外群，使用单拷贝直系同源基因构建了稳健的系统发育树，内部节点的自举值（bootstrap value）都为100%。此树的结构与早期基于少数基因构建的雪雀类系统发育树一致，即雪雀类构成一个单系群。据估计，雪雀类与其他鸣禽的分化时间约在14百万年前（million years ago, mya），三个物种的分化时间分别约在5.7 mya和8.3 mya。

基于基因组数据的系统发育树祖先性状重建雪雀类的共同祖先是否已经拓殖到了高海拔环境？为了回答这个问题，作者使用27个现生雀形目鸟类（总计7个属）的分布海拔数据，发现雪雀属的祖先ancestor已经分布于海平面以上（above sea level, a.s.l.）约3770m，表明它们可能已经拓殖到了青藏高原。除了雪雀类以外，其他雀形目鸟类的祖先大多分布于2000m a.s.l.

以下。而且，与其他雀形目物种分化之后，雪雀类分布海拔的变化范围也相对狭窄。

雪雀及其他雀形目鸟类的分布海拔（左）与体重（右）祖先性状重建那么雪雀类是否演化出了高海拔动物特有的表型特征呢？通常而言，高海拔鸟类比低海拔近缘种的体型更大。基于体重的祖先重建结果表明，ancestor的体重提升至约30g，比大多数雀形目鸟类都更大。在雪雀类内部的分化过程中，adamsi和taczan的体重都继续增加了，而rufico的体重则比祖先减小了----这表明从共同祖先分化之后，雪雀类各个物种的体重发生了物种特异性的演化。

以上结果表明，雪雀属的共同祖先约在14 mya拓殖到高海拔环境并形成了一定的适应性，其后代物种在分化过程中也演化出了物种特异性的表型适应特征。

共同祖先与后代物种的正选择检测既然后代物种的高原适应性特征建立在祖先的基础上，那么有理由推测遗传水平上也会表现出相似的趋势。作者使用paml的枝位点模型（branch-site model），在ancestor中检测到144个受正选择的基因（positive selected genes, PSGs），后代物种中有355-377个PSGs。http://image.sciencenet.cn/home/202103/23/084645z59aa9dsnpn0sa9z.png

共同祖先ancestor与子代物种（adamsi、rufico、taczan）的PSGs数目（红色）以及共享的PSGs数目（橙色）。标记在祖先分支上的为ancestor与三个后代物种都共享的PSGs，标记在物种分支上的为ancestor与此物种共享的PSGs进一步分析发现，祖先与后代物种之间的PSGs基本不同（约占95%）。因此，尽管共同祖先和后代物种中都有相当一部分的基因受到正选择作用，作用于后代物种的选择压力导致了物种特异性的适应性演化，使得不同物种具有不同的PSGs。

在这些PSGs中，如果一个基因只在祖先物种中受到正选择，而在后代物种中没有，那么可以推测三个后代物种通过积累物种特异性的非同义突变产生了不同的适应性。

DTL的受选择情况以及非同义突变数（蓝色）和同义突变数（绿色）

作者以DNA损伤修复有关的基因DTL为例，将同义突变作为对照，研究了非同义突变的分布情况，发现WD40结构域的非同义突变数低于预期。

雪雀中同义突变和非同义突变在WD40与non-WD40的数目从非同义突变数来看，ancestor的WD40结构域与非WD40结构域区域（non-WD40）分别为5和22，同义突变数则分别为10和12。而其近缘种树麻雀（montan）的两种突变在WD40与non-WD40的分布情况则大致相同，非同义突变数为10和24，同义突变数为5和15。

雪雀中同义突变和非同义突变在WD40与non-WD40的分布情况若将同义突变的积累视为中性进化过程，那么ancestor的non-WD40区域可能为正选择主要作用的区域。后代物种则又分别在此区域积累了物种特异性的非同义突变，其中taczan积累较多（4:13），而adamsi和rufico则较少（0:4与0:5）。因此，即使是一个在祖先中高度受选择的基因，后代物种也能在其中积累特异性的非同义突变，进而可能导致了功能上的分化。

祖先和后代物种DTL中非同义突变对酶活性的影响DTL是一种E3泛素连接酶，参与修复紫外线导致的DNA损伤。因此，作者研究了雪雀中的非同义突变是否影响了此酶的修复活性。他们首先使用Provean和Sift对非同义突变的功能效应进行了预测，发现可能影响功能的突变各占6%（Provean）和21%（Sift）；但是两组预测结果的交集只有一个位点（P506L）。

作者接下来使用化学合成的方法获得了完整的DTL编码序列（DTLtaczan、DTLrufico、DTLadamsi、DTLancestor，以及作为对照的DTLmontan），将这些序列分别整合入慢病毒载体（lentiviral vectors），然后在大山雀胚胎成纤维细胞系（embryo fibroblast cell line）（GEF）中检验其DNA修复活性。

DTL修复活性功能试验设计及结果作者使用嘧啶-嘧啶酮光产物（pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct，6-4PP）和环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimmer，CPD）作为DNA损伤程度的指标。结果表明，雪雀类的DTL修复活性明显提升，而且祖先ancestor的DTL与后代物种的DTL活性具有显著区别。

生物学过程富集前述研究表明，后代物种的PSGs和DTL功能都表现出物种特异性的适应性分化，那么这种分化是否也会发生在生物学过程水平上呢？于是作者对祖先和后代物种的PSGs进行了GO注释和功能富集，发现PSGs普遍与发育、信号转导和细胞过程有关。

GO富集结果为了定量研究ancestor与后代物种的差异，作者使用GOSemSim计算GO注释的成对相似度（pairwise semantic similarity，pairwise SS），发现三个后代物种与ancestor的pairwise SS从高到低分别为adamsi、rufico、taczan----这表明三个后代物种与祖先在GO terms的相似度上各不相同。作者使用置换检验对统计显著性进行了检验，ancestor与adamsi、ancestor与rufico都具有统计显著性，而ancestor与taczan的差异则可能是由随机因素产生。

置换检验结果以上结果表明，正选择导致了不同后代物种产生了特异性的适应性分化。

总体来看，雪雀类的高原适应是一个从祖先到后代物种的连续过程。它们的祖先已经拓殖到高海拔区域，并且进化出较大的体型，在与发育和细胞信号相关的基因中受到选择作用。在祖先适应的基础上，三个雪雀物种演化出了各自特异性的适应策略。作者以一个受强选择压力的基因----E3泛素连接酶DTL为例进行功能试验，证明了祖先和后代物种中的非同义突变都提升了此酶修复紫外线DNA损伤的活性。在本研究中，高海拔拓殖产生的适应性演化从共同祖先开始，随后在各个后代物种中发生分化，形成了如今多样化的雪雀类群。