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尿酸检测新方法:单原子钴纳米仿生酶电化学传感器


Single-Atom Cobalt-Based Electrochemical Biomimetic Uric Acid Sensor with Wide Linear Range and Ultralow Detection Limit

Fang Xin Hu, Tao Hu, Shihong Chen, Dongping Wang, Qianghai Rao, Yuhang Liu, Fangyin Dai, Chunxian Guo*, Hong Bin Yang*, Chang Ming Li*

Nano‑Micro Lett.(2021)13:7

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本文亮点

1. 首次探索了单原子钴(A-Co-NG)催化剂用于电化学检测尿酸(UA),并实现了血清标本中UA的检测。

2. 具有高活性、超高金属利用率的A-Co-NG表现出了仿生酶特性,其制备的传感器表现出高灵敏度、高选择性、超宽检测范围以及超低检测限的UA检测性能。

3. 通过实验结果和理论计算相结合,对UA分子在A-Co-NG单原子催化剂上氧化反应过程进行了深入研究。

内容简介

人体内尿酸(UA)含量的检测对于关节炎、先兆子痫、肾脏疾病、心血管疾病等疾病的诊断非常重要。然而要实现UA超长范围及超低极限的检测,仍具有非常大的挑战。单原子钴纳米酶表现出均匀的活性位点、金属原子利用率高且催化动力学快等优点,可以弥补天然酶和纳米酶之间的差距。因此单原子钴传感器不仅能实现血清中UA的高灵敏高选择性检测,而且有助于深入理解催化机理。苏州科技大学李长明教授和胡芳馨博士等针对血清中尿酸含量的检测难以实现超宽线性范围及超低检测极限,且检测机理不明确的问题,首次提出了一种单原子钴纳米酶(A-Co-NG)制备的电化学尿酸传感器。制备的A-Co-NG纳米酶中Co原子平均与3.4个N原子配位,Co原子价态为+2价。该A-Co-NG传感器的检测范围宽(0.4~41950 μM),检测极限为33.3±0.024 nm,明显优于以往报道的基于各种纳米材料的传感器。此外,A-Co-NG传感器亦可用于血清实际样品中尿酸含量的检测。本工作为实现检测范围宽、检测下限低的尿酸传感器提供了一种卓越的材料,满足了实际诊断的需要,为指导其他生物传感过程的探索提供了新的思路。

图文导读

I A-Co-NG材料的形貌结构表征

钴单原子纳米酶(A-Co-NG)制备过程如图1a所示,首先将钴离子(醋酸钴)吸附在氧化石墨烯(GO)上,并与三聚氰胺混合,然后冷冻干燥得到蓬松的混合物,最后在氩气保护气氛中热解制得A-Co-NG催化剂。所制备的A-Co-NG纳米材料具有与石墨烯相似的形貌特征,表现为表面光滑的片状结构(图1b, c)。EDS能谱分析表明Co原子和N原子均匀分布在基底碳材料上(图1d)。通过球差电镜对样品进行了表征,HAADF-STEM图(图1e)显示出孤立的高密度亮点分布在A-Co-NG的整个碳骨架上,说明Co原子在碳基底上以单原子形式存在, Co原子的大小约为0.17 nm,相邻亮点之间的统计距离较大(~0.46 nm),如图1f所示。ICP测得A-Co-NG中Co的含量为1.03 wt% (图1e插图)。XRD数据如图1g所示,仅观察到处于26.2°和44.0°的(200)和(100/110)碳衍射峰,没有Co颗粒或Co金属的特征峰,表明Co原子在石墨烯载体上为原子级均匀分散。

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图1. (a) A-Co-NG纳米酶合成过程示意图。A-Co-NG的结构表征:(b) SEM图像;(c) 亮场TEM图像;(d) EDX映射图像;(e) HAADF-STEM图像,插图为样品中的元素含量;(f) 相邻Co原子间的距离;(g) A-Co-NG和NG的XRD衍射图谱。

采用XPS研究了A-Co-NG的化学组成和元素状态,如图2a-b所示。Co 2p₃/₂在A-Co-NG中的结合能为789.6 eV,与酞菁钴(CoPc)中的Co(II)较为接近,可推断出单原子材料中Co的价态为~+2价。通过对比CoPc(II)和A-Co-NG的N 1s高分辨XPS谱(图2a),在A-Co-NG中吡啶N的成分远高于吡咯N,表明与Co配位的N可能主要为吡啶N (~398.05 eV)。在此基础上,采用X射线吸收光谱(XAS)对A-Co-NG中Co原子的价态和配位结构进行了深入研究(图2c-d)。图2c显示了A-Co-NG和参考样品的K层X射线吸收近边光谱(XANES)。A-Co-NG的Co吸收边能量为7722.3 eV,与CoPc的吸收边能量完全相同,证实A-Co-NG中Co原子的氧化态为+2。如图2d所示,用扩展X射线吸收精细结构傅里叶变换(FT-EXAFs)进一步分析了A-Co-NG中Co原子的配位环境,结果表明只有一个强壳层(1.46 Å),键长比CoPc(II)样品中的Co−N(1.52 Å)键短0.06 Å。在A-Co-NG中没有检测到金属Co中的Co−Co键(~2.16 Å)和CoPc(II)的Co-C键(~2.60 Å)的特征峰,证实了Co原子在石墨烯上是分散的,并通过N原子配位。通过对k3-weighted EXAFS的小波变换(WT)分析,区分了A-Co-NG的1.46 Å处形成峰的散射原子的种类。如图4.2e所示,A-Co-NG和CoPc(II)在相同的k值(6.5 Å⁻1)处强度最大,表明A-Co-NG的第一壳层峰来自与CoPc(II)相同的背散射原子,即N原子。此外,两个样品的Co-N键长的差异表明A-Co-NG中与Co原子配位的N种类与CoPc(II)中的吡咯N不同,这与N1s高分辨XPS谱的结论一致。用Co-N路径拟合了A-Co-NG和CoPC(II)的FT-EXAFS(图4.2f,图S6和表S1),配位数约为3.4。根据结构表征和化学态研究,A-Co-NG的Co原子以+2价态原子级分散在石墨烯上,平均与3.4个N原子配位。

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图2. A-Co-NG和CoPc的(a) N 1S和(b) Co 2p的XPS谱;(c) A-Co-NG的K边XANES谱;(d) 傅立叶变换(相位未校正)的Co K边EXAFS谱;(e) A-Co-NG和CoPC的k3-weighted EXAFS谱的小波变换;(f) A-Co-NG的EXAFS谱的傅里叶变换拟合。

II A-Co-NG对UA氧化的电催化行为

采用电化学方法测定了A-Co-NG对UA催化反应的仿生酶活性。A-Co-NG/GCE的循环伏安(CV)测试性能如图3a黑色曲线所示,基于Co(II)/Co(III)在测试底液0.1 M NaOH溶液(pH=13)中发生准可逆的氧化还原反应,该单原子催化剂产生了一对良好的氧化还原峰。当在测试底液中加入400 μM UA后,氧化电流显著增加,归因于UA发生的氧化反应(图3a红色曲线)。此外,我们准备了一系列对比催化剂,例如P-Co-NG,NG,Co₃O₄/GO复合材料和Co₃O₄来与A-Co-NG纳米酶进行比较。如图3b所示,采用计时电流响应方法系统地研究了各种催化剂的仿生酶活性。A-Co-NG纳米酶表现出最高的催化氧化活性,灵敏度为301.6 μA mM⁻1 cm⁻2。此外,实验表明催化剂的催化活性顺序为A-Co-NG>P-Co-NG>Co₃O₄/GO>Co₃O₄,表明了单原子纳米酶固有的优势(图3c)。通过研究扫速的平方根与催化峰电流之间的关系,进一步探讨了A-Co-NG材料的电化学活性,结果表明催化剂反应过程中电子转移个数为2(图3d)。

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图3. (a) A-Co-NG纳米酶的CV响应曲线;(b) 不同催化剂的计时电流响应;(c) 不同催化剂的响应灵敏度;(d) 扫速的平方根与催化峰电流之间的关系。

在生理条件下,众多生物小分子如抗坏血酸(AA),多巴胺(DA),一氧化氮(NO)等的存在会干扰UA检测。本工作使用安培法在0.3 V (相对于SCE)的条件下,通过分析与UA共存的各种潜在干扰物质,例如AA,DA,葡萄糖(Glu),NO,K⁺,Na⁺,SO₄2⁻和Cl⁻等研究了A-Co-NG和对比催化剂对UA氧化的选择性。结果表明,在混合或单一AA,DA,Glu,NO,K⁺,Na⁺,SO₄2⁻和Cl⁻的存在下,A-Co-NG表现出最佳的选择性和抗干扰能力(图4a)。采用计时电流法测试了A-Co-NG对UA检测的性能如图4b-c所示,结果表明制备的传感器表现出超宽的线性范围(0.4~41950 μM),超低的检出限(33.3 nM),响应时间为2.8秒(图4d)。此外,A-Co-NG纳米酶可在储存180天后保持90.5%以上的活性,表现出良好的稳定性(图4e),表明其保质期很长。通过在相同的实验条件下用五组制备的传感器测定400 μM UA,计算出测试的RSD为1.38%,表明该传感器具有令人满意的重现性和可重复性。为了探索单原子纳米酶传感器对UA的潜在应用,采用标准加入法对三组血清样品进行检测。如图4f所示,回收率在97.7和105.5%之间,表明其具有在实际生物样品中分析UA的潜在应用。

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图4. (a) UA检测A-Co-NG纳米酶的选择性;(b) A-Co-NG的对UA的计时电流响应曲线;(c) A-Co-NG对UA的线性;(d) A-Co-NG对UA的响应时间;(e) A-Co-NG对UA检测的稳定性;(f) 人血清样品中添加标准UA对A-Co-NG进行回收率研究。

III A-Co-NG纳米酶活性的理论研究

为了解A-Co-NG与UA之间的相互作用,首先采用DFT方法计算了UA分子垂直吸附或平行吸附到A-Co-NG上Co原子的吸附能。DFT结果显示,UA在A-Co-NG中Co原子上的垂直吸附和平行吸附构型的相互作用距离分别为2.31和2.38 Å,表明A-Co-NG中Co原子与UA之间的相互作用较弱。基于之前的工作,A-Co-NG单原子催化剂在碱性电解液中氧化反应的决速步骤为羟基(OH⁻)与Co2⁺反应生成Co3⁺。结合UA检测CV实验结果(图3a),也证实UA检测中,A-Co-NG活性中心Co价态为+3。因此可推断,UA在单原子Co中心的氧化反应机理如下:首先Co2⁺中心在氧化电位下与OH⁻结合形成Co3⁺-OH结构,随后UA通过O-H键吸附到Co原子上,形成Co3⁺-OH-UA*中间态,伴随电荷转移,电子从UA传递给Co3⁺-OH,导致N-H键断开,同时三价钴被还原成二价钴。计算得到Co3⁺-OH+*UA态向Co2⁺-H2O+*UA_H态转变的能垒为0.3 eV (图5a),此外*UA_H从Co2⁺-H₂O上脱附所需能量比较小。最后,H₂O分子从Co2⁺-H₂O上脱附下来,催化剂回到原始状态。图5b显示了UA分子在-Co-NG单原子的氧化过程。

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图5. (a) A-Co-NG纳米酶上UA氧化途径的吉布斯自由能谱。(b) UA在A-Co-NG纳米酶上氧化过程的机理示意图。


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